In vitro代謝工学を用いた有用化学品の生産
In vitro metabolic engineering

微生物を利用した化学品生産技術であるバイオプロセスは、持続型産業社会を構築するためのキーテクノロジーとして注目を集めています。バイオプロセスの開発においては、微生物の持つ能力を最大限引き出すために、必要(不必要)な遺伝子の発現を強化(抑制)することで、その代謝経路を改変・制御する代謝工学という手法が汎用されます。しかし、生きた微生物の中には無数の遺伝子やタンパク質からなる複雑な相互ネットワークが存在するため、直接的に代謝に関わる遺伝子を制御するだけでは期待どおりの効果が得られないことも多くあります。 一方、私たちのグループでは「in vitro代謝工学」という新たな技術体系を開発し、これを用いた化学品生産に取り組んでいます。耐熱性酵素を大腸菌などの中温性微生物で発現させ、これらを加熱処理することで必要な酵素だけが活性を保った触媒素子を作成することができます。様々な触媒素子を任意に組み合わせることで、天然には存在しないような代謝経路を自由にデザインすることができます。微生物そのものは加熱処理により死滅しているため、複雑な反応制御を行わずに望みの化学品を生産させることができます。例えるなら、通常の代謝工学が既存の地図上で道を消去したり、新たな道を書き足したりする手法であるのに対し、白紙のキャンバスの上にフリーハンドで地図を描くのがin vitro代謝工学であると言えます。

Bioproduction of value-added chemicals has been widely recognized as a key technology to promote the sustainability of chemical industries. Our group has developed a novel technology to engineer an artificial metabolic pathway specialized for chemical manufacturing by assembling multiple enzymes in vitro. Enzymes from thermophilic microorganisms are heterologously expressed in mesophilic hosts (e.g., Escherichia coli) and used as catalytic modules for pathway construction. This approach is, in principle, available for all thermophilic enzymes as long as they can be functionally expressed in mesophilic hosts, allowing us to design a bespoke metabolic pathway in vitro. We referred to this technology as “in vitro metabolic engineering” and construct a variety of artificial pathways for the on-demand production of useful chemicals.

微生物群集の人為的制御に向けた基盤技術開発
Construction of Engineered Microbiota

これまでの微生物学は、主として純粋培養された単独種の微生物を研究対象とすることで発展してきました。一方、自然環境下において微生物は、他の(微)生物種との間で捕食・寄生・共生といった複雑な相互作用を成す群集として生存しており、単独で存在することはほぼありえません。こうした微生物群集の働きは、地球上の元素循環を促すドライビングフォースのひとつとなっているほか、発酵食品製造や廃水処理の場で古くより産業利用されてもいます。
近年、腸内微生物群集がわれわれの健康に重大な影響を及ぼす事実が知られ始めたことなどを契機に、各種オミクス技術等を用いて微生物群集の振る舞いを分子レベルで「計測・解明」しようという試みが活発化しています。その一方でわれわれは、これら微生物群集を構成する個々の微生物種やそれらの機能を任意に「制御」する技術を未だに有していません。私たちは特定の機能をもった微生物群集の人為的構築、あるいは天然から得られた微生物群集の機能改変に資する新たな技術を開発し、微生物群集を産業や資源循環に積極的に応用するための取り組みを進めています。

Modern microbiology has been developed on the basis of studies on purely isolated microorganisms. In the natural environment, however, most microorganisms present as a part of communities and have complex interactions with other (micro)organisms, such as predation, parasitism, and symbiosis. These microbial communities (microbiota) function as one of the major driving forces to facilitate the biogeochemical cycle on our earth. Besides, they have long been used industrially in the production of fermentation foods and waste-water treatment.
In recent years, many attempts have been made to “monitor and analyze” the behavior and function of microbial communities by using omics technologies. Meanwhile, we still do not have the technology to “control and engineer” the function of microbiota. We aim to develop novel technologies that contribute to the construction of artificial microbiota and apply them to various industries.

疎水性細菌を用いた非水バイオプロセスの開発
Non-aqueous Bioprocess

Behavior of Rhodococcus opacus and Escherichia coli cells in a water-immiscible organic solvent.
The wet cells of R. oapcus (left) and E. coli (right) were put in an Erlenmeyer flask containing cyclohexane and mixed with a magnetic stirrer.

上でも述べたとおり、バイオプロセスの開発においては微生物の持つ能力をいかにして最大限引き出すかが重要なポイントとなります。そのため微生物の通常の生育環境とは程遠い有機溶媒中でこれらを触媒として用いることは極めて困難となります。私たちが研究材料としている細菌ロドコッカス オパカス B-4株は、水・有機溶媒混合液中で有機溶媒相に吸着したり、湿潤状態で有機溶媒に分散したりする「疎水的」特徴を示します。この特徴により、本菌は有機溶媒中に溶解させた化学物質への高い接触能力を示し、通常の微生物よりも効率的にこれらの変換反応を進めることができます。私たちは、ロドコッカス オパカス B-4をはじめとする疎水性細菌を触媒として用いることにより、水に溶けない化学品を対象としたバイオプロセスの実現に取り組んでいます。

The use of organic solvents as reaction media has the potential to greatly expand the repertoire of bioproduction. Successful examples of bioproductionin nonaqueous media using enzymes including lyophilized lipases, esterases,and proteases have been reported. However, most of these biocatalytic convesions involve relatively simple, single-step hydrolytic enzymes. One of the challenges in this area is the utilization of more complex enzymatic reactions involving multicomponent enzymes, cofactor regeneration, and multistep enzymatic conversions in organic solvent. Therefore, attention has been paid to the development of a whole-cell catalyst that functions in non-aqueous environment. Rhodococcus opacus B-4 cells exhibit a high affinity for water-immiscible hydrocarbons and dispersible in essentially water-free organic solvents. Owing to these hydrophobic features, R. opacus B-4 can easily access to the water-insoluble chemicals dissolved in organic solvnets and have an advantage in taking up them. By using R. opacus B-4 cells as “hydrophobic biocatalytic particles”, we are developing no-naquesous bioprocesses for the production of water-insoluble chemicals.

放線菌研究
Actinomycetes and bioactive compounds

 薬の一種である抗生物質や抗ガン剤などの生物活性物質は、今や私たちの健康維持に欠かせない医用化合物です。しかしながら、近年では抗生物質が効かない多剤耐性菌の発生などが社会問題となっており、生物活性物質のさらなる開発が求められています。
 生物活性物質の実に7割が、「放線菌」と呼ばれる微生物により生産されていますが、私たちの研究ではこの放線菌がどのような、またどのようにして生物活性物質を生産するのかを代謝物または遺伝子レベルで明らかにしようと考えています。また、基礎的な研究成果を活用し、生物活性物質の生産プロセス改善や新たな生物活性物質の創製にチャレンジし、産業化に必要な分子基盤を提供しています。
 放線菌における生物活性物質生産は、「放線菌ホルモン」と呼ばれる低分子シグナルによる精密に制御されています。今までに、私たちは極微量しか生産されない放線菌ホルモンの化学構造を決定すると共に、そのシグナル伝達機構を明らかにしてきました。同時に遺伝子工学的手法を用いてシグナル伝達機構を人為的に制御し、生物活性物質の生産プロセスの効率化と生産性の向上化を達成しています。現在は、放線菌ホルモンとそのシグナル伝達機構の多様性の解明に焦点を当てて、研究を進めています。
 従来の生物活性物質探索法では、土壌に生息する放線菌を中心にスクリーニングがなされてきましたが、放線菌はさまざまな環境にも生息することが明らかとなってきました。そこで、私たちは土壌以外の環境に生息する放線菌に注目し、稀少環境の放線菌を分離し、生物活性物質を探索しています。これまでに、マングローブや熱帯植物より分離した放線菌より抗ガン剤などの物質を発見しています。
 また、これらの研究を加速的に発展させるため、私たちは国内・国外問わずに共同研究を実施しています。国内では、北里大学北里生命科学研究所(池田治生教授)と富山県立大学(五十嵐康弘教授)の研究グループを中心に、また国外ではマヒドン大学とカセサート大学の研究グループを中心に、ベトナム・ラオス・カンボジア・オランダ・イギリス・韓国・中国などの幅広いグループと研究交流しています。

Actinomycetes such as Streptomyces genus, Actinoplanes genus and so on, are Gram-positive filamentous bacteria that are well-known for producing a vast array of bioactive compounds, including more than 70% of commercially important antibiotics. The antibiotic production by these organisms is regulated by a variety of physiological and nutritional conditions and is coordinated with processes of morphological differentiation. However, although the commercial importance of antibiotics has led to many years of research, the overall regulatory pathway governing antibiotic production remains obscure.
Elucidation of regulatory and biosynthetic pathway at molecular level provides clues to make a high-producer strain and create novel compounds by genetic engineering. The purpose of this study is to isolate useful actinomycetes strains that produce new bioactive compounds and to know the biosynthetic mechanisms.